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本试剂盒以RNA为模板，RNA→cDNA→PCR在同一体系中连续进行，反应过程中无需添加试剂，无需开盖，避免了污染。一步法RT-PCR技术可用于RNA分子的检测和结构分析、cDNA克隆、RNA水平上的特定的基因表达分析等多种领域的应用。

本试剂盒采用高质量的AMV反转录酶和Taq DNA聚合酶，以及本公司研发的反应体系，大大提高了反应的扩增性能和特异性。本试剂盒已将RT-PCR反应中用到的Buffer、dNTP及体系稳定剂配成10×One Step RT-PCR Buffer，使得实验操作更加方便。

• RNA样品要避免基因组DNA污染。用于cDNA合成的器具须用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液37℃处理12h；然后在120℃高压灭菌30min去除残留的DEPC。
  
• 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60min)或者上述DEPC处理的器具盛装，使用的无菌水须加入0.1% DEPC，然后进行高温高压灭菌。建议RNA实验使用的器具、试剂和无菌水专用。
  
• 使用本试剂盒进行RT-PCR反应时，应使用基因特异性引物(GSP)，不能使用Oligo dT及随机引物，否则将会导致RT-PCR产生非特异性产物，目标RT-PCR产物的产量也会减少。
  
• 当同时进行多次RT-PCR反应时，应将各种试剂配制成混合液然后分装到各个管中，以减少实验操作或实验之间的误差（整个反应过程应在冰浴条件下进行）。
  
• 本试剂盒中的反转录酶可在37～50℃条件下正常工作，42℃为该酶的最适温度。对于富含GC二级结构的RNA，可以适当提高反转录的工作温度，但是温度超过50℃ RT-PCR产物的得率会有所降低。
  
• 对于大多数模板而言，镁离子终浓度在1.2mM效果较好，如果需要可用提供的5mM MgCl₂来进一步调节至更为合适的浓度（通常在1.2～2.0mM之间）。

• 待模板RNA、10×One Step RT-PCR Buffer、特异性引物溶解后，轻微短暂离心，然后冰浴放置。
  
• 在冰浴的试管中加入如下RT-PCR反应混合物：
  

  成分	用量
  10×One-Step RT-PCR Buffer	5μL
  正向引物(10μM)	2μL
  反向引物(10μM)	2μL
  AMV RTase	0.5μL
  RNase inhibitor	0.5μL
  Taq DNA polymerase	0.5μL
  模板RNA	X μL
  RNase-free ddH2O	至50μL

• 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应
  

  温度	时间	循环数
  45℃	10～30min	1
  94℃	5min	1
  94℃	30sec	30～40
  40～65℃	30sec
  72℃	1 kbp/min
  72℃	10min	1

  
  
  • 退火温度：根据实际情况，可适当的在40～65℃之间降低或升高退火温度。
    
  • 延伸时间：根据目的产物的长度而定，一般情况下1 kbp需设定时间1min左右。
    
  • 循环次数：通常情况下设定为30～40个循环，cDNA量较少时可适当增加循环次数。
• 反应结束后，取5～10μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

• RT-PCR电泳条带很弱或者物产无扩增
  
  • 提取的RNA被降解，可能提取或保存的过程中污染了RNase。建议提取RNA的材料要尽量新鲜，实验所用的试剂耗材无核酸酶，提取的RNA于-70℃保存。
    
  • RNA中包含逆转录反应的抑制剂。逆转录抑制剂包含：SDS，EDTA，甘油，亚精胺，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐等。
    建议将样品RNA和对照RNA混合，与对照RNA比较产量，以检验是否存在抑制剂。可以通过70%的乙醇对RNA沉淀进行清洗，除去抑制剂。
    
  • PCR反应失败，PCR的退火温度，延伸时间，循环次数不够，同样没有产物扩增。这种情况建议对退火温度进行梯度优化；对于不同目标产物长度的PCR延伸时间建议1 kbp/min；PCR的循环次数建议30～40个循环。
    
  • 第一链cDNA产物取用量过多，建议第一链cDNA产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10。
• RT-PCR产物中出现非特异性条带
  
  • 引物和模板非特异性退火。建议在引物设计时避免3'端有2~3个dG或dC；在RT-PCR反应中使用基因特异性引物，而不是随机引物或者oligo dT；使用热启动的Taq DNA聚合酶进行RT-PCR反应，提高反应的特异性。
    
  • 尝试使用降落PCR，在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
    
  • RNA中有基因组DNA污染。使用RNase-free的DNase I处理RNA；可将cDNA进行1:10，1:100，1:1000倍稀释，以降低基因组DNA污染所造成的影响。镁离子的最适浓度通常在1.2～2.0mM。
    
  • 镁离子浓度过高，可对每组模板和引物组合的镁离子浓度进行优化，可从1.0～3.0mM，每隔0.5mM，进行梯度优化，以确定最佳的镁离子浓度。
    
  • 污染外源DNA。RT-PCR反应最好在通风橱或者超净工作台或者比较洁净的环境中进行操作；RT-PCR反应最好使用无核酸酶的离心管，PCR管以及吸头；建议RT-PCR的器具、试剂及无菌水专用；实验操作时注意每次更换吸头。